Le diagnostic de la maladie de Lyme repose avant tout sur la présence de symptômes compatibles avec la maladie et la notion d’un risque d’exposition, comme des promenades en forêt ou une exposition dans le jardin (même sans souvenir d’une morsure). Un risque d’exposition et des signes typiques de maladie, tels qu’un érythème migrant, sont suffisants pour poser un diagnostic et initier le traitement.
Dans les cas douteux ou présentant des facteurs de gravité, un test de laboratoire est demandé. La sérologie (recherche d’anticorps) est la méthode de diagnostic de laboratoire de préférence. En cas de résultat positif ou douteux, un test de confirmation est réalisé (Western blot). Des tests de recherche directe du pathogène (examen microscopique, culture, biologie moléculaire) peuvent être réalisés dans certaines situations, mais ne sont disponibles que dans quelques laboratoires spécialisés et sont souvent peu sensibles.